4. Juni - Färben, färben, färben…
05.06.2014 -
Nachdem wir nun wissen, dass wir sehr viele, intakte und auswertbare Zellen haben, besteht der nächste Schritt der Analysen im Färben der Zellen mit verschiedenen Antikörpern mittels Immunzytochemie.
Mit diesen Antikörpern wollen wir immunrelevante Molekülstrukturen und Bestandteile des Zell-Skeletts sichtbar und quantifizierbar machen. Zudem färben wir auch jedes Mal die Zellkerne und das Zell-Plasma an. Und mittels einer Spezial-Färbung können wir festzustellen, ob die Zelle zum Zeitpunkt der Fixierung noch bei bester Gesundheit war oder nicht. Nur mit allen Kriterien zusammen sind verlässliche Aussagen möglich.
Um die Slides zu färben, braucht es erst einmal ein Protokoll, das wir immer zuerst schreiben und welches die verwendeten Slides, die benötigten Reagenzien und die jeweiligen Inkubationszeiten festlegt. Die Auswahl der jeweiligen Slides ist gar nicht so einfach, da wir nur eine begrenzte Anzahl davon haben und natürlich nichts verschwenden wollen. Die Slides können an Sollbruchstellen in jeweils 16 Sub-Slides aufgeteilt werden. Von jeder Gruppe und Kondition müssen wir dann immer genug Sub-Slides haben, damit die Resultate danach miteinander verglichen und sinnvolle Schlüsse gezogen werden können. Für jeden Antikörper und somit für jedes zu färbende Molekül benötigen wir, je nach Protokoll, etwa 30 bis 45 Sub-Slides, die dann natürlich alle gemeinsam gefärbt werden.
Da unsere Sub-Slides so klein sind, hat es sich bewährt, das Färben in 100-200 Mikroliter-Tropfen durchzuführen. Dabei werden die Sub-Slides mit der Pinzette genau nach Protokoll in den jeweiligen Tropfen mit verschiedenen Reagentien überführt. Dafür braucht man eine sehr ruhige Hand J So eine Färbung für einen Antikörper dauert im Ganzen zwei Tage und nach dem Einbetten müssen die Slides auch noch über Nacht trocknen.
Es ist und bleibt also jedes Mal spannend, da wir erst am jeweils dritten Tag nach jeder Färbesequenz am Mikroskop sehen können, ob alle Komponenten der Färbung funktioniert und ob sich unsere Erwartungen erfüllt haben.
Nachdem wir nun wissen, dass wir sehr viele, intakte und auswertbare Zellen haben, besteht der nächste Schritt der Analysen im Färben der Zellen mit verschiedenen Antikörpern mittels Immunzytochemie.
Mit diesen Antikörpern wollen wir immun-relevante Molekülstrukturen und Bestandteile des Zell-Skeletts sichtbar und quantifizierbar machen. Zudem färben wir auch jedes Mal die Zellkerne und das Zell-Plasma an. Und mittels einer Spezial-Färbung können wir festzustellen, ob die Zellen zum Zeitpunkt der Fixierung noch bei bester Gesundheit waren oder nicht. Nur mit allen Kriterien zusammen sind verlässliche Aussagen möglich.
Um die Slides zu färben, braucht es erst einmal ein getestetes Protokoll, das die verwendeten Slides, die benötigten Reagenzien und die jeweiligen Inkubationszeiten festlegt. Die Auswahl der Slides ist gar nicht so einfach, da wir nur eine begrenzte Anzahl davon haben und natürlich nichts verschwenden wollen. Die Slides können an Sollbruchstellen in jeweils 16 Sub-Slides aufgeteilt werden. Von jeder Gruppe und Kondition müssen wir dann immer genug von diesen Sub-Slides haben, damit die Resultate danach miteinander verglichen und sinnvolle Schlüsse gezogen werden können. Für jeden Antikörper und somit für jedes zu färbende Molekül benötigen wir, je nach Protokoll, etwa 30 bis 45 Sub-Slides, die dann immer alle gemeinsam gefärbt werden. Tag für Tag, Woche für Woche.
Da unsere Sub-Slides so klein sind, hat es sich bewährt, das Färben in 100-200 Mikroliter-Tropfen durchzuführen. Dabei werden die Sub-Slides mit der Pinzette genau nach Protokoll in den jeweiligen Tropfen mit verschiedenen Reagentien überführt. Dafür braucht man eine sehr ruhige Hand :-) So eine Färbung für einen Antikörper dauert im Ganzen zwei Tage und nach dem Einbetten müssen die Slides auch noch über Nacht trocknen.
Es ist und bleibt also jedes Mal spannend, da wir erst am jeweils dritten Tag nach jeder Färbesequenz am Fluoreszenz-Mikroskop sehen können, ob alle Komponenten der Färbung funktioniert und ob sich unsere Erwartungen erfüllt haben.